Em 1942 aquando da instalação do Museu no Palácio da Mitra, a colecção, reunida até à data, foi considerada, por Mário Tavares Chicó como precária e insuficiente, tendo inclusivamente condicionado o programa museológico. Deste núcleo inicial da colecção (hoje considerado como o fundo antigo do Museu) constava documentação do Arquivo Histórico, pinturas, gravuras, desenhos, cerâmicas, azulejos e objectos arqueológicos. À época a colecção foi ainda completada com o espólio do Arquivo Fotográfico.

Mas a partir desta data, com a criação dos “Serviços de Museus” começou-se a adquirir sistematicamente espólios de proveniências diversas: demolições de edifícios, intervenções arqueológicas, incorporações de objectos de diferentes serviços da CML, doações e aquisições.

A aquisição mais importante e significativa para o Museu, foi a da colecção Augusto Vieira da Silva, em 1953, composta de variadas tipologias de objectos de todas as épocas. Foi sobretudo este espólio que o grande olisipógrafo reuniu durante toda a sua vida para integrar um museu da história da cidade de Lisboa, que permitiu criar um discurso museológico coerente e de acordo com o objectivo traçado para o Museu. A colecção deu origem ao Gabinete de Estudos Olisiponenses que, em 1976, acabaria por ser integrado no Museu da Cidade para, mais tarde, em 1984, adquirir autonomia (GEO- Palácio Beau Séjour), acabando o museu por ficar com parte do espólio museológico, tendo perdido o arquivo e a biblioteca olisiponense.

Hoje o Museu da Cidade possuiu a mais vasta colecção de iconografia da cidade de Lisboa, desde o século XVI ao XX, inícios do XXI (pintura, desenho, gravura, litografia, impresso, fotografia). Cartografia e Projectos urbanísticos e arquitectónicos. Um conjunto importante de artes decorativas destacando-se a cerâmica e a azulejaria. Elementos arquitectónicos diversos de monumentos e edifícios da cidade. Objectos do quotidiano desde a pré-história à época industrial e imaginário religioso. Colecções temáticas (Camões, República, etc.). Maquetas e esculturas, entre outros espólios.